Der Handschriftenbestand der Bibliothek umfasst etwa 1.000 mittelalterliche und neuzeitliche Manuskripte von verschiedenen Eigentümern. So sind die hier aufbewahrten 420 Domhandschriften Eigentum des Domkapitels, während die 365 Diözesanhandschriften, gleich wie die übrige Bibliothek, zum Besitz der Erzdiözese gehören. Aus dem Eigentum des Dominikanerordens werden 167 Handschriften der Bibliothek St. Albertus Magnus mitverwaltet. Hinzu kommen zahlreiche Fragmente, die zum Teil separat aufbewahrt werden, zum größeren Teil jedoch als Makulatur in älteren Einbänden zu finden sind.
Die Verwaltung des gesamten Handschriftenbestandes sowie der ca. 700 Inkunabeln obliegt der Handschriftenabteilung. Hier werden Anfragen zu einzelnen Handschriften oder Inkunabeln bearbeitet, Bildrechte vergeben und die wissenschaftliche Erfassung des Gesamtbestandes betrieben. Wegen ihres größeren historischen Gewichts standen bisher überwiegend die Domhandschriften im Vordergrund des Interesses, während die Diözesanhandschriften und jene aus der Bibliothek St. Albertus Magnus bislang nur unzureichend erschlossen sind.
Die mittelalterlichen Handschriften bis zum Jahr 1550 sind im “Handschriftencensus Rheinland” (Wiesbaden 1993) nachgewiesen. Ausführliche Beschreibungen aus vorwiegend kunsthistorischer Sicht von 102 Handschriften finden sich im Ausstellungskatalog “Glaube und Wissen im Mittelalter” (München 1998). Das CEEC-Projekt führte diese und weitere Katalogtexte unter der jeweiligen Signatur zusammen und ermöglichte erstmals das digitale Blättern in den Handschriften. Auf einer neuen technischen Plattform werden diese Texte und Bilder nun sukzessiv über die Digitalen Sammlungen der Bibliothek zugänglich gemacht. Wichtiger Bestandteil der wissenschaftlichen Erschließung des Kölner Handschriftenbestands sind schließlich die Beiträge des alle zwei Jahre stattfindenden Symposiums „Mittelalterliche Handschriften der Kölner Dombibliothek“, die zeitnah in den Tagungsbänden innerhalb der Reihe „Libelli Rhenani“ veröffentlicht werden. Inkunabeln können im gedruckten „Inkunabelkatalog der Erzbischöflichen Diözesan- und Dombibliothek“ (Köln 1997) und – mit aktualisierten Angaben – in der Datenbank INKA recherchiert werden.