In der Diözesan- und Dombibliothek befinden sich etwa 1.000 mittelalterliche und neuzeitliche Manuskripte von verschiedenen Eigentümern. 

Der Handschriftenbestand der Kölner Dombibliothek ist noch heute im Besitz des Domkapitals und somit eine „Dauerleihgabe“ von einzigartigem wissenschaftlichen und künstlerischen Rang. Die Bibliothek besteht seit den Tagen des Kölner Erzbischofs Hildebald (†818) und geht auf dessen Handschriftensammlung zurück. Genau 100 dieser Manuskripte sind vor dem Jahr 1000 entstanden.

Die Handschriften der Diözesanbibliothek sind auf unterschiedlichen Wegen in den Besitz der Bibliothek gelangt: Nach der Säkularisation von Klöstern und Stiften kamen sie überwiegend bereits im 19. Jahrhundert in die damalige Bibliothek des Priesterseminars, die Anfang des 20. Jahrhunderts auch Bestände aus alten Pfarrbibliotheken erhielt.

Aus dem Eigentum des Dominikanerordens werden schließlich die Handschriften der Bibliothek St. Albertus Magnus mitverwaltet. Weitere mittelalterliche Manuskripte befinden sich im Besitz einzelner Pfarreien des Erzbistums Köln.

Der mittelalterliche Handschriftenbestand der Diözesan- und Dombibliothek sowie der externe Streubesitz wurde von 2000 bis 2004 im Rahmen des von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten Projektes Codices Electronici Ecclesiae Coloniensis digitalisiert. 2018/19 wurden die Digitalisate der circa 400 Handschriften in die Digitalen Sammlungen integriert. Zu den jeweiligen Handschriften werden verschiedene Katalogbeschreibungen und die Forschungsliteratur nachgewiesen.